Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Всероссийский научно-исследовательский институт
цветоводства и субтропических культур»
(ФГБНУ ВНИИЦиСК)

   (862) 296-40-21
  (862) 246-80-16
27032017 0
На базе лаборатории агрохимии и почвоведения ФГБНУ ВНИИЦиСК проводятся исследования в области изучения состава и структуры микробных комплексов ризосферы и почвы под культурами чая и персика (различные сорта) на фоне агрогенного воздействия (комплекс факторов, включающий совместное применение минеральных удобрений, агромелиорантов, пестицидов).
Важным этапом в этой работе является идентификация микроорганизмов, позволяющая не только выделить виды характерные для почв изучаемых агроценозов, но и определить возможные различия в видовом составе, связанные с разной степенью ассоциации с растением.
Исследования такого плана проводились на базе лаборатории технологии микробных препаратов ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии г. Пушкин (Ленинградская область) в период с 13 по 22 февраля 2017 года.
Идентификации микроорганизмов предшествовала работа по выделению ризосферных и почвенных бактерий естественной и агрогенно-преобразованной почвы, отбору доминирующих морфотипов и получению чистых культур.
Для этого начиная с июня 2015 по октябрь 2016 год из почвы фонового участка буково-грабового леса (Дагомыс, Уч-Дере), а также двух локусов почв чайной плантации (почва междурядья и ризосфера чайного растения) на ГМФ – агаре были выделены изолированные колонии бактерий (рис. 1). Из общего их числа было отобрано 30 доминирующих морфотипов.
Колонии каждого морфотипа описывали по протоколу и производили посев в пробирки на косой агар, получая чистую культуру. Созданная таким образом коллекция штаммов, хранилась в стерильном холодильнике.
На базе института сельскохозяйственной микробиологии г. Пушкин была проведена идентификация бактериальных штаммов с помощью молекулярно-генетического анализа IGS-области ДНК.
IGS (Inter genic spacer) – единственная кодирующая непрерывная область ДНК, содержащая значительные изменения последовательностей нуклеотидов. Данная область повторяется множество раз в геноме и, по мнению некоторых исследователей, является самой чувствительной целью в геноме для проведения идентификации. Структура IGS весьма сложна и неодинакова у разных видов бактерий, как по нуклеотидной последовательности, так и по организации.
Основными этапами работы было: выделение бактериальной ДНК и амплификация фрагментов гена IGS (ПЦР).
Выделение бактериальной ДНК из чистых культур проводили в следующей последовательности:
• получение суточной культуры выделенных штаммов, для чего был произведен посев чистых культур с косого агара в пробирках на пептонный агар в чашки Петри (рис. 2);
• получение лизатов бактериальных штаммов (рис. 3), т.е. освобождение ДНК из микробных клеток путем разрушения клеточных стенок химическими реагентами и термическим воздействием (нагрев до 95 ◦С и резкое замораживание) (рис. 4);
• проведение электрофореза в 1 % агарозном геле на основе 0,5 % буфера TAE для проверки качества выделенной ДНК.
Для амплификации фрагментов гена IGS было необходимо:
• приготовление ПЦР – смеси, включающей все компоненты, необходимые для процесса: лизат штамма, содержащий ДНК-матрицу; дезоксирибонуклеотиды; Taq-полимеразу – термостабильный фермент, который может строить ДНК из дезоксинуклеотидов; IGS-праймеры – короткие искусственно синтезированные фрагменты ДНК, необходимые Taq-полимеразе в качестве затравки;
• проведение ПЦР (полимеразной цепной реакци) в строго контролируемых условиях, которая осуществлялась с использованием термоциклера Bio-Rad С1000 (США), длительность процесса 1,5 часа (рис. 5);
• оценка результатов ПЦР электрофоретически в 3 % агарозном геле на основе 0,5 % буфера ТАЕ.
Заключительным этапом было – сбор полученной в ходе ПЦР ДНК с помощью электрофореза на 1,5%-агарозовом геле (рис.6), затем выделение из геля на адсорбент (Silica) и перенос ДНК с адсорбента в жидкую буферную среду (элюирование) для передачи на секвенирование.
Таким образом, молекулярно-генетический анализ IGS-области бактериальной ДНК, позволил определить принадлежность выделенных штаммов к тому или иному виду. Результаты исследования планируется опубликовать в совместной статье журнала «Сельскохозяйственная биология».

Автор: Рогожина Е.В. науч. сотрудник
лаборатории агрохимии и почвоведения